CCK-8 細胞增殖.毒性檢測試劑盒

Cell Counting Kit（CCK-8試劑盒）

產品簡介：

Cell Counting Kit簡稱CCK 試劑盒，為MTT法的替代方法，是一種基于WST（水溶性四唑鹽，化學名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽）的廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。

CCK-8法與其它檢測方法之間的比較：

CCK用途：藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗

 操作說明：

一、制作標準曲線（測定細胞具體數量時）

1、先用細胞計數板計數所制備的細胞懸液中的細胞數量，然后接種細胞。

2、按比例（例如：1/2比例）依次用培養基等比稀釋成一個細胞濃度梯度，一般要做3-5個細胞濃度梯度，每組3-6個復孔。

3、接種后培養2-4小時使細胞貼壁，然后加CCK試劑培養一定時間后測定OD值，制作出一條以細胞數量為橫坐標（X軸），OD值為縱坐標（Y軸）的標準曲線。根據此標準曲線可以測定出未知樣品的細胞數量（試用此標準曲線的前提是實驗的條件要*，便于確定細胞的接種數量以及加入CCK后的培養時間。）

二、細胞活性檢測

1、在96孔板中接種細胞懸液（100μL/孔）。將培養板放在培養箱中預培養（在37℃,5% CO₂的條件下）。

2、向每孔加入10 μL的CCK溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數）。

3、將培養板在培養箱內孵育1-4小時。

4、用酶標儀測定在450nm處的吸光度。

5、如果暫時不測定OD值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。在24小時內吸光度不會發生變化。

三、細胞增值-毒性檢測

1、在96孔板中配置100μL的細胞懸液。將培養板在培養箱預培養24小時（在37℃，5% CO₂的條件下）。

2、向培養板加入10μL不同濃度的待測物質。

3、將培養板在培養箱孵育一段適當的時間（例如：6、12、24或48小時）。

4、想每孔加入10μL CCK溶液（注意不要再孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數）。

5、將培養板在培養箱內孵育1-4小時。

6、用酶標儀測定在450nm處的吸光度。

7、如果暫時不測定OD值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。在24小時內吸光度不會發生變化。

注意：如果待測物質有氧化性或還原性的話，可在加CCK之前更換新鮮培養基（除去培養基，并用培養基洗滌細胞兩次，然后加入新的培養基），去掉藥物影響。當然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養基，直接扣除培養基中加入藥物后的空白吸收即可。
 備注：
①建議先做幾個孔摸索接種細胞的數量和加入CCK試劑后的培養時間。
②有條件的情況下建議采用多通道移液器，可以減少平行孔減的差異。加入CCK試劑時，建議斜貼著培養板壁加，不要插到培養基頁面下加，容易產生氣泡，會干擾OD值讀數。
③白細胞可能需要培養較長時間。
④當使用標準96孔板時，貼壁細胞的zui小接種量至少為1,000 個/孔 (100 μL 培養基)。檢測白細胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2,500 個/孔 (100 μL 培養基)。如果要使用24孔板或6孔板實驗，請先計算每孔相應的接種量，并按照每孔培養基總體積的10%加入CCK溶液。
⑤如果沒有450nm的濾光片，可以使用吸光度在430-490 nm之間的濾光片，但是450nm濾光片的檢測靈敏度zui高。

⑥培養基中酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。

活力計算：

細胞活力*（％）=[A(加藥)-A（空白）]/[A（0加藥）-A（空白）] ×100
A（加藥）：具有細胞、CCK溶液和藥物溶液的孔的吸光度
A（空白）：具有培養基和CCK溶液而沒有細胞的孔的吸光度
A（0加藥）：具有細胞、CCK溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度
*細胞活力：細胞增殖活力或細胞毒性活力

1.一個孔中應接種多少個細胞當使用標準96孔板時，貼壁細胞的zui小接種量至少為1,000 個/孔 (100 μl 培養基)。檢測白細胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2,500 個/孔 (100 μl 培養基)。如果要使用24孔板或6孔板實驗，請先計算每孔相應的接種量，并按照每孔培養基總體積的10%加入CCK-8溶液。

2.能否用384孔板進行試驗？

可以。向各孔中加入培養基體積10%的CCK-8溶液，如果加入的CCK-8體積太少，可以先將CCK-8溶液稀釋1倍，然后加入培養基體積20%的量。

3.能否用24孔板進行試驗？

可以。向各孔中加入培養基體積10%的CCK-8溶液。

4.酚紅會影響檢測嗎？

不會。培養基中酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。

5.CCK-8與胸苷結合檢測之間是否有相關性？

有。然而，請注意由于CCK-8使用的檢測原理與胸苷檢測的不同，因此結果可能不同。

6.CCK-8能否檢測細菌細胞？

可以檢測E.coli，但不能檢測酵母細胞。向100 μl E.coli培養液中加入10 μl CCK-8溶液，隔夜或培養1-4個小時7.CCK-8穩定嗎？

CCK-8在0-5℃下能夠保存至少6個月，在-20℃下避光可以保存1年。如果需要長期保存，我們推薦-20℃的儲藏條件。

8.如果沒有450 nm的濾光片，還可以使用哪些其他濾光片？

還可使用450 nm到490 nm之間的濾光片。

9.如何減少由于CCK-8試劑在槍頭上或孔壁上的殘留所帶來的誤差？

可以在加樣前用培養基稀釋CCK-8試劑并混勻后加樣。

10.CCK-8是什么顏色？

應該是粉紅色。若顏色不一樣，有可能會影響測定。

11.CCK8能否對活細胞進行染色？

不能。因為CCK8的主要成分是一種水溶性的四唑鹽 (WST8)，并通過電子載體1Methoxy PMS將活細胞中的電子交換到培養基中的WST8上。由于生成的甲ā也是高度水溶性的，因此CCK8不能對細胞進行染色。

12.CCK8檢測溶液對細胞是否有毒？

CCK8溶液自身因為高濃度的1Methoxy PMS的存在而具有一點毒性。但是，加到培養基中的CCK8是沒有毒性的，因為被稀釋了10倍。因此，長時間的培養，如隔夜或者培養數天是可以的。同一個細胞培養液在CCK8檢測后還可以用于其他細胞增殖檢測，如結晶紫檢測，中性紅檢測或者DNA熒光檢測等。由于每種細胞對于CCK8的耐受力都不同，因此在需要進行長時間培養時，先檢測一下細胞在加入CCK8培養后的活力。

13.在做加藥實驗時，藥物對測定是否有影響？如何解決？

有時會有影響。如果藥物具有還原性，會和CCK8發生顯色反應，增加吸光度。解決辦法：首先要確認藥物是否有吸收，在含有藥物的培養基中加入CCK8，測定450 nm的吸光度，如果它的吸光度比不含藥物的培養基 (加CCK8)的吸光度高，則證明藥物有影響，可在加CCK8之前更換培養基，去掉藥物的影響。

14.每次測定的數值不一樣，是什么原因？如何解決？

可能會有以下幾個原因： 1. 當在培養箱內培養時，培養板zui外一圈的孔zui容易干燥揮發，由于體積不準確而增加誤差。 一般情況下，zui外一圈的孔只加培養基，不作為測定孔用。 2. 有可能會因為CCK8沾在壁上而產生誤差，建議在加入CCK8后，輕輕敲擊培養板以幫助混勻。 3. 每孔的細胞數量過多或過少。請預先在1,000100,000個/孔范圍內摸索條件。

15.如何設定空白對照？

在不含細胞的培養基中加入CCK8，培養一定的時間，測定450 nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實驗(細胞毒性實驗)時，還應考慮藥物的吸收，可在不含細胞，加入藥物的培養基中加入CCK8，培養一定的時間，測定450 nm的吸光度作為空白對照。

16.哪些物質會影響CCK8的測定？

當有還原性物質存在時會影響CCK8的測定，例如含有維生素C的Glucose等 (一般培養基中的量不多，酚紅或血清不影響測定)。在有酚紅存在的情況下，會增加空白吸收，但不影響測定，扣除空白吸收即可。

17.在實驗中吸光度值太高，如果不能減少細胞數量，如何解決？

可以縮短加入CCK8后的培養時間。例如：可以把加入CCK8試劑后的培養時間由2小時縮短為1小時。

18.設定參比波長的目的是什么？必須設定嗎？

不一定要設定。CCK-8試劑在參比波長沒有吸光度。設定參比波長的目的是為了取出由于樣品混濁所帶來的吸收。

19.說明書上僅寫了96孔板的測定方法，如果使用24孔板貨12孔板，應該加多少量CCK-8試劑？…

一般情況下建議加入CCK-8試劑的量是培養基體積的1/10。

20.在CCK-8顯色過程中，如何終止反應？

有一下幾種方法（96孔板）： 1、 在顯色反應后，將培養板仿佛4℃冰箱內。 2、 每孔加10 μl 0.1 M HCL溶液。 3、 每孔加10 μl 1%（w/v）的SDS（十二烷基硫酸鈉）溶液。注意：反應停止后，應在24小時之內測定。

21.必須預培養細胞嗎？

不一定。如果要向保持細胞的狀態，建議預培養細胞。如果不做細胞預培養，細胞內的脫氫酶可能會不穩定。也有人不做細胞預培養，但在做標準曲線和檢測時需要統一檢測條件。

22.如果加入的藥物中含有金屬，是否會有影響？

金屬對CCK-8顯色有影響。當終濃度為1 Mm的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制5%、15%、90%的顯色反應，使靈敏度降級。如果終濃度是10 Mm的話，將會100%抑制。

23.CCK-8試劑的保存條件？

在避光條件下CCK-8試劑在4℃可保存一年。如果需要保存較長時間的話，推薦在-20℃下保存。但是CCK-8若反復解凍和冰凍將會增加空白吸收，從而影響檢測結果，若經常使用可將試劑存放在4℃冰箱內保存。

24.預培養后，更換培養基需要細胞計數嗎？

一般情況下用胰蛋白酶處理對數增長期的細胞，用血球計數盤計數，制備成一定濃度的細胞懸液即可。如果想要精密計數細胞的話，可以預培養后取培養基用血球計數盤進行計數。

25.CCK-8對于不同的細胞，靈敏度是否一樣？

不一樣，懸浮細胞與貼壁細胞相比較難染色。對于貼壁細胞，一般加入CCK-8培養1-4小時吸光度已經很高，但對于懸浮細胞則可能吸光度較低，可以通過延長CCK-8的加入時間或增加細胞數量來解決。

26.懸浮細胞和貼壁細胞在數量上有何區別？

懸浮細胞由于染色比較困那，一般需要增加細胞數量和延長培養時間。貼壁細胞染色比較容易，若細胞數量過大，有時吸光度會超過酶標儀的讀數。

27.應該每次做標準曲線嗎？

建議每次做。雖然細胞是一樣的，但是細胞的狀態不一定一樣，對于狀態不一樣的細胞，建議每次做標準曲線。如果試劑的批號不一樣，靈敏度可能會有輕微的差異，對于不同的批號建議分別做標準曲線。

28.有時在藥物作用情況下，細胞已經死亡，但是脫氫酶的活性還在，是否能計算細胞數量？…

不能。由于CCK-8是通過和細胞內的脫氫酶進行反應間接反映活細胞數量，如果細胞已經死亡，但脫氫酶的活性還在，則試劑測定的細胞數量將會比真實值高，不能真實反映活細胞數量，建議采用別的方法測定。

29.實驗之前，是否需要先檢測一下培養基和CCK-8是否會反應？

建議使用一個孔作一下檢測，因為有培養基中可能含有氧化還原反應的物質，在正式實驗之前有必要先確認培養基和CCK-8是否反應。一般正常在的OD值應該在0.4以下。

保存條件：

4℃干燥避光保存，有效期一年。