一、 Western blot概述 Western Blot 法采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經過 PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如 NC膜， PVDF膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。 A. 蛋白抽提 -蛋白樣品的制備 蛋白抽提試劑 | 起始材料 | 產品名稱 | 貨號 | 規格 | 價格 （RMB） | 品牌 | 大腸桿菌 | BugBuster protein extraction reagent | 70584-3 | 100ml | 1059 | Merck | BugBusterMaster Mix extraction reagent | 71456-3 | 100ml | 2377 | Merck | 酵母細胞，真菌，植物 | YeastBuster protein extraction reagent | 71186-3 | 100ml | 1194 | Merck | 昆蟲 /哺乳動物細胞 | CytoBuster protein extraction reagent | 71009-3 | 50ml | 915 | Merck | 哺乳動物細胞 | RIPA buffer solution | 89900 | 100ml | 923 | Pierce | 哺乳動物組織 | T-PER 動物組織蛋白抽提試劑 | 78510 | 500ml | 3405 | Pierce | 細胞不同部位蛋白提取試劑盒 | 起始材料 | 產品名稱 | 貨號 | 規格 | 價格 （RMB） | 品牌 | 哺乳動物細胞 /組織 | ProteoExtract 全蛋白質組抽提試劑盒 | 539779 | Kit | 5165 | Merck | 哺乳動物細胞 /組織 | ProteoExtract 亞細胞蛋白質組抽提試劑盒 | 539790 | 20T | 6081 | Merck | 哺乳動物細胞 /組織 | ProteoExtract 跨膜蛋白抽提試劑盒 | 71772-3 | 20T | 6014 | Merck | 哺乳動物細胞 /組織 | ProteoExtract 天然跨膜蛋白抽提試劑盒 | 444810 | KIT | 5481 | Merck | 哺乳動物細胞 | NE-PER 核蛋白 -胞漿蛋白抽提試劑盒 | 78833 | Kit | 2586 | Pierce |
B. 蛋白酶 /磷酸酶抑制劑 對細胞進行裂解后，與目標蛋白一起釋放出來的還有蛋白酶和磷酸酶，它們會水解蛋白為多肽或氨基酸。此過程會導致許多重要蛋白的流失，進而嚴重的影響下有實驗。因此需要在細胞的裂解過程中加入相應蛋白酶或磷酸酶抑制劑，從而保證目標蛋白的完整性。 單一成分蛋白酶抑制劑 | 抑制劑 | 貨號 | 規格 | 價格（RMB） | 品牌 | 靶蛋白酶家族 | 可溶解 | PMSF |
| 1g | 300 | Mpbio | 絲氨酸蛋白酶（可逆型） | 甲醇 | AEBSF | J582 | 50mg | 798 | Amresco | 無毒的 PMSF替代物，絲氨酸蛋白酶（不可逆） | 水 | 亮抑蛋白肽（leupeptin） |
| 5mg | 871 | Mpbio | 絲氨酸 ,半胱氨酸蛋白酶（可逆型） | 水 | 抑肽酶 （Aprotinin） |
| 5mg | 268 | Mpbio | 絲氨酸蛋白酶（可逆型） | 水 | 胃抑肽酶 A（Pepstain A） |
| 5mg | 531 | Mpbio | 天冬氨酸蛋白酶（可逆型） | 甲醇 | 抑氨肽酶（Bestatin） | J579 | 10mg | 1784 | Amresco | 氨基酸多肽酶（可逆型） | 甲醇 | E-64 | J586 | 5mg | 1348 | Amresco | 可逆型半胱氨酸（不可逆） | 水 | EDTA ， 2Na |
| 500g | 1138 | Mpbio | 金屬蛋白酶（可逆型） | 水 |
單一蛋白酶抑制劑的作用譜始終是受限制，多數情況下未必能*保證目的蛋白活性不受影響，尤其需要檢測同一樣品內的多個蛋白時。“Cocktail” -蛋白酶 /磷酸酶混合物此時就是*的選擇了。 蛋白酶抑制劑混合片劑（ EASY packs） | 抑制劑 | 貨號 | 規格 | 價格（RMB） | 品牌 | 特點 | cOmplete ， mini | 5892970001 | 30 片 10ml | 2470 | Roche | 同時持續抑制絲氨酸蛋白酶 ,半胱氨酸蛋白酶及金屬蛋白酶等在內的多種蛋白酶；可應用幾乎所有的組織及細胞提取物，包括動物，植物，酵母，細菌和真菌樣品；整個操作過程只需要將片劑*溶解到裂解液中； | Complete,mini,EDTA-Free | 5892791001 | 30 片 10ml | 2470 | cOmplete | 4693116001 | 20 片 50ml | 3339 | cOmplete ， EDTA-Free | 4693132001 | 20 片 50ml | 3339 | 磷酸酶抑制劑混合片劑（ EASY packs） | 抑制劑 | 貨號 | 規格 | 價格（RMB） | 品牌 | 特點 | PhosSTOP | 14906845001 | 10 片（10ml） | 1292 | Roche | 同時持續抑制包括酸性和堿性磷酸（脂）酶，及絲氨酸 /蘇氨酸蛋白磷酸（脂）酶和酪酸蛋白磷酸（脂）酶在內的多種酶；與 cOmplete蛋白酶抑制劑兼容。 | PhosSTOP | 14906837001 | 20 片（10ml） | 2432 |
C. 蛋白樣品的定量 目前常用比色法來確定樣品蛋白的含量。將化學試劑加入到蛋白樣品溶液中發生顏色變化，利用分光光度計或酶標儀檢測這一變化，并與已知濃度的蛋白標準曲線做比較從而確定樣品的濃度。WISSEN公司提供 Pierce公司的蛋白定量產品， pierce的 BCA蛋白定量試劑盒是zui的產品之一，深受研究人員的依賴。 常用蛋白定量試劑盒 | 產品名稱 | 貨號 | 規格 | 價格 （RMB） | 檢測波長 | 重要兼容物 | 重要不兼容物 | 蛋白間的均一性 | BCA 蛋白定量試劑盒 | 23227 | 250T | 1254 | 562nm | 去污劑 | 還原劑，螯合劑 | 高 | 改良 Lowry法蛋白定量試劑盒 | 23240 | 480T | 1338 | 750nm | SDS | 大部分去污劑，還原劑，螯合劑 | 高 | 考馬斯蛋白定量試劑盒 | 23200 | 630T | 1175 | 595nm | 還原劑和螯合劑 | 去污劑 | 低 | 660 納米蛋白定量試劑盒 | 22662 | 300T | 2136 | 660nm | 去污劑，還原劑 | 離子型去污劑 | 低 | 蛋白標準品及單一試劑 | 產品名稱 | 貨號 | 規格 | 價格 （RMB） | 檢測波長 | 白蛋白標準品 | 23209 | 10*1ml | 611 | 常用蛋白標準品，高純度，易獲得 | 牛血清γ -球蛋白標準品 | 23212 | 10*1ml | 765 | 測定抗體濃度時常用的標準品 | BCA 蛋白定量試劑 A | 23228 | 500ml | 991 | 成分：堿性碳酸鹽緩沖液中含 BCA和酒石酸鹽 | BCA 蛋白定量試劑 B | 23224 | 25ml | 488 | 成分： 4%無水硫酸銅溶液 | 福林酚試劑 | F9252 | 100ml | 365 | Lowry 法總蛋白定量用試劑（ 2N） | | | | | | | | | | | |
D. 蛋白樣品濃縮于純化 為了節省樣本，提高下有實驗的成功率，需要對蛋白樣品進行濃縮，從而提高蛋白樣品的有效檢測濃度。在此本公司提供由 Millipore（密理博）的超濾濃縮管（離心過濾），以簡單的離心方法將您的蛋白樣品濃縮?？蛻艨筛鶕亓舻姆肿恿?，膜類型，樣本體積來選擇該產品 超濾濃縮管 | 產品名稱 | 膜類型 | 起始體積 | 濃縮體積 | 回收率 | 規格 | 截留分子量 | 貨號 | 0.5ml 超濾管 | Ultracel （超濾） | 0.5ml | 15-20ul | ≥ 90% | 24 個 /盒 | 3kDa | UFC500324 | 10kDa | UFC501024 | 4ml 超濾管 | Ultracel （超濾） | 4ml | 50ul | ≥ 90% | 24 個 /盒 | 3kDa | UFC800324 | 10kDa | UFC801024 | 15ml 超濾管 | Ultracel （超濾） | 15ml | 200ul | ≥ 90% | 24 個 /盒 | 3kDa | UFC900324 | 10kDa | UFC901024 |
E. SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳（ SDS-PAGE） SDS-PAGE 的基本原理是在蛋白質樣品中加入 SDS和含強還原劑巰基乙醇或 DTT的樣品處理液。 SDS作為強陰離子表面活性劑，破壞蛋白質分子的二級和三級結構；強還原劑斷開二硫鍵破壞蛋白質的四級結構，是蛋白質分離解聚成單鏈分子。解聚后的側鏈與 SDS充分結合形成帶負電荷的蛋白質 -SDS復合物，此時蛋白質的電泳遷移率則與所帶電荷的性質無關，主要取決于蛋白質的相對分子質量。因此 SDS-PAGE電泳可將不同分子量大小的蛋白質分離開，從而便于對目的蛋白進行研究。 SDS-PAGE 電泳結束后常常通過染色和脫色評定結果的優劣，一般選擇考馬斯亮藍 R-250進行染膠，染色靈敏度高。另外也常常對轉膜后的凝膠上殘余蛋白進行染色，來分析轉膜效果的好壞。 聚丙烯酰胺凝膠的配置 | 產品名稱 | 貨號 | 規格 | 價格（ RMB） | 品牌 | 丙烯酰胺 /甲叉雙丙烯酰胺 Acryl/Bis solution （19: 1）, 40% （w/v） | SD6012 | 500ml | 176 | Sangon | 丙烯酰胺 /甲叉雙丙烯酰胺 Acryl/Bis solution （29: 1）, 40% （w/v） | SD6017 | 500ml | 176 | Sangon | 丙烯酰胺 /甲叉雙丙烯酰胺 Acryl/Bis solution （37.5: 1）, 40% （w/v） | SD6014 | 500ml | 176 | Sangon | 十二烷基硫酸鈉（ SDS） | L5750 | 500g | 280 | Sigma 分裝 | （ TEMED） ; N,N,N ’ ,N’ -四甲基乙二胺 | T2250 | 100ml | 196 | Sigma 分裝 | （過硫酸銨） Ammonium persulfate | 0486 | 100g | 120 | Amresco 分裝 | Western Blotting 緩沖體系的配置 | 產品名稱 | 貨號 | 規格 | 價格（ RMB） | 品牌 | Tris | 0234 | 100g | 105 | Amresco 分裝 | 甘氨酸（ Glycine） | Japan | 500g | 80 | Japan | β -巰基乙醇 - 違禁品 | 0482 | 100ml | 120 | Amresco 分裝 | Bromophenol blue 溴酚藍 | 0449 | 10g | 112 | Amresco 分裝 | Glycerol 甘油 | G7893 | 250ml | 95 | Sigma 分裝 | DTT 二硫蘇糖醇 | 233155 | 10g | 330 | Merck 分裝 | 考馬斯亮藍 R-250 | 04821616 | 25g | 389 | Mpbio | Ponceau S 麗春紅 S |
| 10g | 273 | Mpbio | Lane Marker Reducing Sample Buffer | 39000 | 5 mL | 699 | Pierce | Lane Marker Non-Reducing Sample Buffer | 39001 | 5ml | 699 | Pierce |
F 蛋白 Marker 蛋白分子量標準（ Marker）不僅具有指示蛋白條帶對應的分子量大小，還可以檢測蛋白轉移師傅成功或者蛋白樣品在凝膠上的電泳程度等作用。選擇合適的 Marker不僅方便準確的定性目的蛋白，還能夠很好的監測整個實驗體系，一遍分析可能遇到的問題， Fermentas公司提供了各種范圍的未染色 /預染色的蛋白 Marker以及修飾標記蛋白 Marker。 蛋白 Marker選擇 | 產品名稱 | 舊貨號 | 貨號 | 規格 | 價格（ RMB） | PageRuler Unstained Protein Ladder 10-200kDa | SM0661 | 26614 | 2*250ul | 300 | PageRuler Unstained Broad Range Protein Ladder 5-250 kDa | SM1881 | 26630 | 2*250ul | 500 | PageRuler Prestained Protein Ladder, 10-170kDa | SM0671 | 26616 | 2*250ul | 870 | PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 -250kDa | SM1811 | 26619 | 2*250ul | 1100 |
G 轉膜與封閉 電泳結束后需要將分離后的蛋白質從凝膠體系中轉移到固相載體（如 PVDF膜， NC膜）上，并在膜上進行一抗，二抗的孵育與洗滌，zui后進行顯色。使用考馬斯亮藍 R-250對轉膜后的凝膠上殘余蛋白的檢測，可以監測轉膜效果的好壞。 膜 | 產品名稱 | 貨號 | 規格 /卷 | *（RMB） | 膜的選擇 | 0.2um NC 膜 | 10401396 | 30cm*3.00M | 2200 | 7-20KD 蛋白 | 0.22um PVDF 膜 | ISEQ00010 | 30cm*3.00M | 2200 | 適用蛋白測序和低分子量蛋白印跡 | 0.45um PVDF 膜 | IPVH00010 | 26.5cm*3.75m | 1690 | 適用多種印跡實驗 |
封閉（ Blocking）是 western blot 以及其他免疫實驗中*的步驟之一，封閉的好壞直接影響背景高低，從而決定是否能跑出一張美觀的 WB圖。 WB封閉的目的是結合印跡膜上的非特異性位點，常用的如脫脂奶粉， BSA，吐溫 -20. 產品名稱 | 貨號 | 規格 | 價格（RMB） | 品牌 | 脫脂奶粉 | D8340 | 500G | 385 | BD | BSA（ 無蛋白酶 ） |
| 25g | 385 | Mpbio | BSA （標準級） |
| 25g | 300 | Mpbio | 吐溫 -20 | 0210316890 | 500ml | 238 | Mpbio |
H顯色 化學顯色檢測 | 產品名稱 | 貨號 | 規格 | 價格（ RMB） | 品牌 | DAB（ 二氨聯苯胺 ） |
| 1g | 211 | Mpbio | TMB （ 3,3',5,5'-四甲基聯苯胺） |
| 1g | 858 | Mpbio | BCIP（ 對甲苯胺藍 ） |
| 25mg | 420 | Mpbio | NBT（ 氯化硝基四氮唑藍 ） |
| 250mg | 932 | Mpbio | NBT/BCIP 染色試劑 | 08980871 | 100ml | 699 | Mpbio | DAB 顯色試劑盒 黃色 | AR1021 | KIT | 240 | Boster | DAB 顯色試劑盒 藍色 | AR1024 | KIT | 240 | Boster | AEC 顯色試劑盒 紅色 | AR1020 | KIT | 140 | Boster | NBT/BCIP 染色試劑盒 | AR1023 | KIT | 280 | Boster | 化學發光檢測試劑 | ECL 化學發光底物 | 32109 | 50ml | 633 | Pierce | 32106 | 500ml | 2174 | Pierce | SuperSignal West Pico 化學發光底物（皮克級） | 34080 | 500ml | 2837 | Pierce | SuperSignal West Dura 持久性化學發光底物 | 34075 | 100ml | 3285 | Pierce | 超敏化學發光底物 | 34095 | 100ml | 4263 | Pierce | X 光片 | 5*7in | 100 片 | 160 | 柯達 |
I 抗體剝離與膜再生 當同一個樣本中含有兩個或兩個以上的蛋白需要檢測，當對某一個蛋白的檢測結果不理想需要調整實驗條件貨重新分析做驗證實驗，有了抗體剝離試劑，講印跡膜上的抗體洗脫，讓你在同一張膜上做多次雜交實驗，讓你免去重復做電泳和轉膜的繁瑣不走，大大節省你的試驗時間和成本。 化學顯色檢測 | 產品名稱 | 貨號 | 規格 | 價格（ RMB） | 品牌 | Restore TMWestern Blot stripping buffer | 21062 | 30ml | 332 | Thermo | 21059 | 500ml | 1127 | Thermo |
J 內參抗體 內參即內部參照，對于哺乳動物細胞表達來說一般是指由管家基因編碼表達的蛋白，它們在各種組織和細胞中的表達相對恒定，在檢測蛋白的表達水平變化時常用做參照物。 內參的作用： 1檢測整個 WB流程是否正常，包括轉膜，顯色及發光體系等； 2檢測基因表達產物是否正確及表達產微量的相對變化； 3校正上樣誤差，確保蛋白定量結果的可信度； 常用的內參抗體 | 貨號 | 名稱 | 適應種屬 | 應用范圍 | 規格 | 價格（ RMB） | 1854-1 | β -actin（ 42kDa） | HU,Ms ， Rt | WB,IHC,ICC | 100ul | 2500 | 50ul | 1400 | 2251-1 | GAPDH （ 36kDa） | HU,Ms ， Rt | WB,IHC,ICC ， IP | 100ul | 2500 | 50ul | 1400 | 12009-1 | β -Tubulin（ 50kDa） | HU,Ms ， Rt | WB,IHC,ICC,FC,IP | 100ul | 2500 | 50ul | 1400 |
H 標簽抗體 沃比森公司提供的標簽抗體涵蓋 6-Histidine， Flag-tag， HA tag， c-Myc， GST.GFP等常用標簽，種類齊全，特異性高，是進行融合蛋白研究*的輔助工具之一。 |
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