RT-PCR 實驗原理與步驟

實驗材料：
水稻葉片的 RNA 。

實驗原理：目前 PCR 技術只能擴增 DNA 模板，對 RNA 模板不能直接擴增。mRNA反轉錄生成的 cDNA 可作為 PCR 的模板進行擴增，這種在 mRNA 反轉錄后進行的 PCR 擴增稱為 RT-PCR 。 RT-PCR 比 Northern 雜交更靈敏，對 RNA 的質量要求較低，操作簡便，它是在轉錄水平上檢測基因時空表達的常用方法。本實驗以水稻葉片 RNA 為材料，檢測β -actin 基因的表達。實驗中設定2 個陰性對照：一個不加模板 RNA ，另一個不加反轉錄酶，主要是消除 DNA 及PCR 試劑方面引起的假陽性；同時以葉片 DNA 為陽性對照，檢驗 PCR 試劑和擴增過程是否有問題。

實驗步驟：
RNA 抽提
1. 用TRIzol 試劑提取植物總RNA。
2. 將總RNA 稀釋到終濃度1μg/μl 。
3.在0.5 ml 的無菌eppendorf 管中分別加入:
Total RNA 0.5- １ μ g
RNase-free DNase I １ μ l （ １ u / μ l）
10 × DNase I buffer 1 μ l
DEPC 處理的ddH2O 5 μ l
4. 37 ℃ 保溫15 min, 然后70 ℃ 保溫10 min. 。
反轉錄反應
1. 加1μl 500 μ g / ml oligo （dT）15 primer, 渦旋混合，簡單離心。
2.在65 ℃加熱混合物10 分鐘, 然后室溫10 分鐘，再分別加入下列試劑：
5 × *鏈緩沖液4μl
0.1 M DTT 2μl
10 m M dNTP 1μl
3.渦旋混合后，簡單離心，37℃水浴2 min.。
4. 加2μl 200 U / ml 的M-MLV 反轉錄酶。輕緩混合，37℃保溫1h。其總體積應為20μl。
5. 70 ℃加熱15 min 終止反應，然后加20μl 的ddH2O ，cDNA *鏈可作為模板用于PCR 擴增。
6. 若要去除與cDNA 互補的RNA，可加1μl （2 units）的RNase H，然后37 ℃保溫20 min。
PCR 擴增
1. 在冰上混合加入下列試劑：
cDNA *鏈 1μl
TaKaRa Ex Taq （5u/1μl） 0.5μl
10 × Ex Taq buffer 5μl
dNTP mixture （2mM） 4μl
Primer F （10 mM） 2μl
Primer R （10 mM） 2μl
ddH2O 35.5μl
2. PCR 反應程序
Step 1 94℃ 3min 1
Step 2 94℃ 1min， 60℃ 1min， 72℃ 1min， 30-40 Cycles
Step 3 72℃ 5 min 1
Step 4 4℃ forever
3. 以β-actin 作為每個RT-PCR 的內在標準，以水代替反轉錄酶來檢測RT-PCR
中的DNA 污染。
所使用試劑
5 × *鏈緩沖液 （GIBCO Part No.Y00146）
100 mM DTT （GIBCO Part No.Y11147）
200 U/μl M-MLV Reverse transcriptase （GIBCO Part No.28025-021）
500μg/ml oligo （dT） 15 primer （Promega Cat. No. C110A 9362612）
10 mM dNTP 混合物
RNase-free DNase I （TaKaRa Code No. 2215 CA）
5U/μl Ex Taq polymerase 和10 × buffer （TaKaRa Code No. RR001D CA）
10μM specific Primer F and R
Sterile ddH2O